background image

6.  

   Транскрипция   –   етапи   и   молекулни   механизми.   Инициация   на   транскрипцията.   Регулация   на

инициацията   при   бактерии.   Цис-   и   транс   действащи   фактори   (елементи).   Промоторни   регулаторни
елементи.   Позитивен   и   негативен   контрол.   Модел   на   Жакоб   и   Моно.   Регулация   на  

 

 lac

      и  

   trp

     оперона.

Двукомпонентни регулаторни системи. 

Екпресията на информацията, кодирана от даден ген, включва формирането на РНК молекула, която се

транскрибира   от   ДНК   матрица.   Функциите   на   РНК   се   изразяват   в   съхраняване   и   предаване   на   генетичната
информация.   Освен   това   някои   РНК   молекули   участват   в   каталитични   процеси   (рибозимите).   Всички   РНК
молекули, с изключение на геномите на някои вируси, са носители на информацията, кодирана от ДНК. По време
на транскрипцията генетичната информация с помощта на ензимна система се прехвърля от двойноверижната
ДНК молекула върху едноверижно РНК копие, като се спазва правилото за комплементарност. Получават се три
основни   класа   РНК   молекули:  иРНК  (носи   информация   за   аминокиселинната   последователност   на   дадена
полипептидна верига);  тРНК  (чете информацията, кодирана в иРНК и носи съответните АК за удължаване на
полипептидната   верига);  рРНК  (компоненти   на   рибозомите,   които   осигуряват   синтезата   на   полипептидната
верига). Същесвтуват много специализирани РНК молекули с регулаторни и каталитични функции. 

При репликацията обикновено се копира цялата хромозома, докато транскрипцията е селективен процес.

Само определени групи от гени се транскрибират в дадения момент, а някои части от ДНК генома са постоянно
нетранскрибируеми. Специфични регулаторни секвенции определят началните и крайни точки на ДНК участъците,
които ще се използват като матрица при транскрипцията. 

Подобно   на   ДНК  полимеразите,   които   осигуряват   репликацията   на   генетичния  материал,   съществуват

ензими – ДНК-зависими-РНК-полимерази. Нуждаят се от ДНКова матрица, рибонклеозидтрифосфати – АТФ, ГТФ,
УТФ и ЦТФ и Mg

2+

.  Ензимът свързва и един Zn

2+

  йон. Активността на РНК полимеразата е най-висока, когато е

свързана   към   ДНК   молекула.   Матрицата   се   копира   в   посока   3'-5'   посока,   т.е.   антипаралелна   на   посоката   на
синтеза на РНК веригата. Спазва се правилото за комплементарност, като срещу Г от ДНК застава Ц от РНК, а
срещу А от ДНК застава У от РНК. 

За   разлика   от   ДНК   полимеразите,   РНК   полимеразите   не   се   нуждаят   от   праймер   за   инициация   на

транскрипцията.   Инициацията   настъпва,   когато   РНК   полимеразата   се   свърже   със   специфични   ДНК
последователности,   наречени  промотори.   5'-трифосфатният   край   на   първия   нуклеотид   от   насцентната   РНК
молекула   остава   интактен   по   време   на   транскрипцията.   По   време   на   елонгацията   растящата   РНК   верига
временно формира къса хибридна структура с ДНК матрицата. 

За да се осигури матрица за синтезата на РНК двете вериги на ДНК трябва да се разплетат. Образува се

транскрипционно „мехурче”. Движението на РНК полимеразата по ДНКовата матрица предизвиква  положително
свръхспирализиране  на ДНК непосредствено пред ензима и  отрицателно свръхспирализиране  непосредствено
зад него. Топологичното напрежение в ДНК молекулата се освобождава с помощта на ензимите топоизомерази.

Двете вериги на ДНК молекулата имат различно значение за транскрипционния процес. Веригата, която

служи като матрица за синтез на РНК, се означава като antisense

 

  верига. Комплементарната й верига се означава

като sense (кодираща) верига, тъй като нейната нуклеотидна последователност е идентична на тази на РНКовия
транскрипт.

ДНК-зависимата-РНК полимераза при  

E.coli

  представлява комплексен ензим,

състоящ   се   от  пет   корови   субединици   (α

2

ββ

   `  ω)  и   една  допълнителна   шеста

субединица σ, която варира по размер. σ-субединицата се свързва временно към ДНК.
Тези шест субединици съставлляват РНК полимеразния холоензим. При прокариоти
се   срещат   различни   РНК   полимеразни   холоензими,   в   зависимост   от   вида   на   σ-
субединициата. 

РНК-полимеразата не притежава 3'-5' екзонуклеазна активност, както повечето

ДНК полимерази. Следователно честота на грешките по време на транскрипцията се
повишава   –   10

-4

  -10

-5

.   Много   РНК   полимерази,   включително   бактериалните   и   РНК

полимераза  II  при   еукариотите,   преустановяват   движението   си   при   свързване   на   грешна   база.   Могат   да
отстраняват грешно свързана база откъм 3` края на транскрипта, като реакцията, която осъществяват е обратна
на реакцията на полимеризация. 

Инициацията

  на   РНК-овата   синтеза   започва   от   точно   определено   място   в   молекулата   на   ДНК.   РНК

полимеразата разпознава и се свързва със специфични секвенции от ДНК, наречени  промотори. Те определят
транскрипцията на точно определени сегменети от ДНК молекулата. Нуклеотидните последователности, за които
се свързва РНК полимеразата, са относително вариабилни. При  

E.coli

  РНК полимеразата се свързва в област,

обхващаща 70 нуклеотидни двойки преди стартовото място за транскрипцията и 30 нуклеотидни двойки след
него.   Т.е.  промоторът   се   простира   от   -70   до   +30   позиция.   Изследванията   са   доказали   сходство   между
нуклеотидните последователности на бактериалните промотори в областта от 

-10

 до 

-35

 позиция. Тази област е

изключително важна за σ-субединициата. Въпреки че липсва пълна идентичност на бактериалните промотори от
този клас, все пак присъствието на едни и същи нуклеотиди на някои места говори за наличието на консенсусни
последователности.   Консенсусната   последователност   при   -10   позиция   е   (5')TATAAT(3'),   а   тази   -35   -
(5')TTGACA(3').  Трета   AT-богата   област,   наречена  UP  (upstream  promoter)  елемент  е   налице   между  

-40  и  -60

позиция в промоторите на някои активно експресиращи се гени. UP елементът се свързва със субединица от РНК
полимеразата. Ефективността на свързване на РНК полимеразата към промоторното място, както и инициацията
на транскрипцията, зависят от разстоянието между изброените дотук последователности и от отдалечеността им
от стартовото място за транскрипцията. При 

E.coli

 съществуват няколко класа промотори, които се разпознават от

различни   σ-субединици.   Промоторът   за   heat-shock   гените   се   разпознава   от   σ

32

.   σ

70  

разпознава   повечето

промотори в областта -10 до -35 позиция. σ

54

 разпознава промотори на гени от азотния метаболизъм. 

background image

Инициацията на транскрипцията се състои от две фази (свързване и

иницииране), всяка състояща се от множество стъпки. Първоначално РНК
полимеразата се захваща за промотора като образува  затворен комплекс
(ДНК е интактна) и след това се формира отворен комплекс (ДНК е частично
разплетена в близост до -10 позиция). След това иницииращият комплекс
претърпява конформационни промени и се превръща в елонгиращ комплекс,
отдалечен   от   промотора.   σ-субединициата   дисоциира   от   комплекса   след
като той премине във фазата на елонгация.

Един от основните механизми за 

регулация

 на генната експресия е

контрол  върху инициацията  на  транскрипцията   на   гена,   кодиращ  дадения
клетъчен   белтък.   Клетката   сама   преценява   от   какви   белтъци,   от   какво
количество   и   колко   бързо   се   нуждае   от   тях   в   дадения   момент.   Когато
транскрипцията   на   даден   ген   е   потисната,   то   съответната   иРНК   и
кодираните от нея белтъци се експресират с ниска скорост. И обратното,
когато даден ген е  активиран, съответни иРНК и белтъци се получават с
много по-висока скорост. 

При   повечето   бактерии   и   други   едноклетъчни   организми   генната

експресия   е   подложена   на   активна   регулация.   Това   е   необходимо   с   цел
ензимните системи и останалите  структурни  компоненти в клетката да  се
настроят към променящите се условия на живот в околната среда. Във всеки
един момент бактериалната клетка синтезира само онези белтъци, които са
й   необходими,   за   да   оцелее   при   дадените   условия   на   живот.   При  

Е.coli

половината от гените са групирани под формата на оперони. Всеки от тях е
отговорен за синтезата на ензими, ангажирани в определена метаболитна
пътека   или   белтъчни   молекули,   които   взаимодействат  помежду   си,   за   да
формират мултимерен протеинов комплекс. Така например триптофановият
оперон  кодира   петте   ензима,   необходими   за   биосинтезата   на   триптофан.
Подобно   на   него,  lac

       оперонът  кодира   трите   ензима,   осигуряващи

метаболизирането на лактозата. 

Бактериалният   оперон   се   транскрибира   от   едно   стартово   място   и

продуктът,   който   се   генерира,   е   единична   иРНК   верига   (полицистронна).
Следователно гените в рамките на един оперон се регулират координирано,
т.е. активират се или се потискат едновременно и с еднаква сила. При 

Е.coli

σ-субединицата на РНК полимеразата действа като фактор на инициация на
транскрипцията. 

Контрол на  lac-оперона

  - Когато  

E.coli

  се постави в среда, в която липсва лактоза, синтезата на иРНК,

която се кодира от  lac  оперона, е потисната. По този начин клетката не изразходва  енергия за синтезата на
ензими,   които   не   са   й   необходими   в   момента.   Когато   в
средата   присъстват   лактоза   и   глюкоза,  

E.coli

  избирателно

метаболизира глюкозата. Лактозата се включва в клетъчния
метаболизъм едва, когато резервите от глюкоза в средата са
изчерпани.   Транскрипцията   на  lac  оперона   се   потиска   дори
при наличие на лактоза в средата, докато цитозолните нива
на глюкоза не се понижат. Транскрипцията на lac оперона при
различни   условия   се   контролира   от   lac   репресор   и
катаболитен   активаторен   белтък   (CAP).   Всеки   от   тях   се
свързва   със   специфична   ДНК   последователност   от   lac
регулаторния участък. 

За   да   започне   транскрипцията   на   lac   оперона   е

необходимо   σ-субединицата   да   се   свърже   с   lac  промотора,
който   е   разположен  upstream  срямо   стартовото   място   за
транскрипцията. При липса на лактоза в средата и свързване
на  lac

     репресора  към последователност, наречена  оператор,

РНК   полимеразата   не   може   да   инициира   транскрипция   на
оперона. При наличие на лактоза в средата тя се свързва с
всяка   една   от   субединиците   на   тетрамерния  lac  репресор,
като   предизвиква   конформационни   промени   в   него.   В
резултат   на   тези   промени  lac  репресорът   се   отделя   от
оператора  и полимеразата  може  да инициира  транскрипция
на lac оперона. При наличие обаче и на глюкоза в средата
скоростта   на   инициация   на   транскрипцията   (колко   пъти   за
една   минута   различни   РНК   полимерази   инициират
транскрипция на lac оперона) е много ниска. 

При   изчерпване   на   глюкозата   от   средата   концентрацията   й   в   клетка   рязко   се   понижава.   Клетъчният

отговор на 

E.coli

 се изразява в генериране на цикличен АМФ (цАМФ). Когато концентрацията му се повиши, той се

свързва с димерния CAP белтък. Последният претърпява конформационни промени, които му позволяват да се
свърже   с   CAP–сайта   на   lac  региона,   контролиращ   транскрипцията   на   оперона.  CAP-цАМФ  

 

 комплексът

взаимодейства   с   полимеразата,   която   е   свързана   към   промотора.   Повишава   се   скоростта   на   инициация   на

background image

транскрипцията. Такава активация води до синтез на значителни количества lac иРНК и съответно до повишаване
концентрацията на ензимите, кодирани от този оперон. 

Трите ензима, които се кодират от  lac  оперона, са галактозидаза (Z), пермеаза (A) и трансацетилаза (Y).

Подредени са в оперона в този ред. Г  алактозидазата разгражда лактозата до галактоза и глюкоза; Пермеазата е
необходима   за   транспорт   на   захари,   вкл.   лактоза   през   клетъчната   мембрана;  Трансацетилазата  прехвърля
ацетилова   група   от   ацетил-КоА   върху  β-галактозид,   като   се   предполага,   че   това   може   да   е   необходимо   за
детоксикация и екскреция на неметаболизирани продукти на галактозата. 

Всеки ген при прокариотите притежава в 5` края си последователности, които се транскрибират, но не се

транслират. Известни са като Шайн-Далгарно (

 

 SD

   )   секвенции. В иРНК транскрипта те служат за позициониране на

малката субединица на рибозомата, тъй като са комплементарни на 3` края на рРНК (16S).

Изо-пропил-тио-галактозид (

 

 IPTG

 

 ) се явява структурен аналог на лактозата. Той действа като индуктор за

експресията на lac оперона. Свързва се с репресорния белтък, в резултат на което той се отделя от операторното
място   и  lac  оперонът   се   експресира.   Освен   това  IPTG  не   се   разгражда   от   галактозидазата,   кодирана   от  lac
оперона.

Х-

   gal е структурен аналог на лактозата, но притежава индолово ядро. Галактозидазата действа върху Х-

gal, като освобождава индоловото ядро, на което се дължи синьото оцветяване. Използва се за установяване
дали има или не експресия на lac оперона. В среда с глюкоза колониите на 

E.coli

 остават бели, докато в среда на

лактоза или на IPTG колониите са сини.

Понякога   обаче   дори   в   среда   на   глюкоза   някои   колониите   са   сини.   Това   се   дължи   на   конститутивни

мутации в операторното място, при което lac оперонът се експресира постоянно. Такива мутации се означват като
ОС мутации. Репресорният белтък не се свързва с операторното място. Когато генът за галактозидазата също е
мутантен, се синтезира неактивен ензим. В среда без индуктор ще се експресира галактозидазата, но тя няма да
е активна. Пермеазата също ще се експресира. Колониите и при дивия щам, и при мутанта остават бели. При
добавяне на IPTG (индуктор) колониите на дивия щам стават сини, а тези на мутантния остават бели. При дивия
щам се синтезира активен ензим, докато при мутантния дори в присъствие на индуктор се синтезира неактивен
ензим. Експериментът доказва, че съществуват ДНК последователности, които са отговорни за регулацията на
транскрипцията на даден оперон, но само в рамките на конкретна ДНК молекула. 

Този   тип   мутации   са   доминантни   по   отношение   на   дивия   тип.   Означават   се   като   цис-мутации.  

Цис-

регулаторните елементи 

влияят само върху конкретната ДНК молекула. Могат да засегнат както операторното

място, така и промотора. При внасяне на мутация в гена, отговорен за синтез на репресорния белтък, той се
синтезира, но в неактивно състояние. Колониите са сини, независимо, че липсва индуктор. 

Трансдействащите елементи

 са рецесивни по отношение на дивия тип и оказват влияние върху няколко

НК  молекули  (РНК,  хромозомна  ДНК,  плазмидна  ДНК).   Трансдействащи  регулаторни  елементи  са  тези,  които
могат да дифундират в цитозала като белтъци и РНК молекули. 

Промоторите  за  различните гени при  

E.coli

  показват  известна хомология,  но  въпреки това  точните  им

последователно се различават до известна степен. Промоторните секвенции определят съответно скоростта, с
която РНК полимераза-σ-комплексът инициира транскрипцията на дадения оперон в отсъствието на репресор или
активатор. Промоторите, които определят висока честота на инициация на транскрипцията, се означават като
силни промотори, а тези, които опредеят ниска честота – слаби промотори. 

Транскрипцията на повечето гени в  

E.coli

  се регулира от процеси, които са сходни с описаните при lac

оперона. Най-общо механизмът се изразява в свързването на специфичен репресор към операторното място на
гена или към оперона. Малка молекула(и), наречена индуктор, се свързва с репресорния белтък и по този начин
контролира нивото на транскрипция в зависимост от клетъчните нужди. 

Триптофановият   оперон

  включва   гените,   които   кодират   ензимите,   отговорни   за   синтезата   на   АК

триптофан. Когато концентрацията на триптофан в средата и в цитозола на клетката е висока, не се налага да се
синтезират ензимите, кодирани от триптофановия оперон. Свързването на триптофана към репресорния белтък
предизвиква   конформационни   промени   в   него,   които   му   позволяват   да   се   свърже   към   операторното   място.
Потиска се експресията на ензимите, отговорни за синтезата на триптофан. Когато концентрацията на триптофан
в средата и в цитозола на клетката се понижи, триптофанът дисоциира от репресорния белтък. В последния
настъпват конформационни промени и той напуска операторното място. Транскрипцията на оперона се инициира.

Повечето промотори на  

E.coli

  изискват σ

70

-РНК полимеразния комплекс. Транскрипцията на някои групи

гени   обаче   се   осъществява   от   РНК   полимерази,   които   носят   различни   σ

 

фактори   и   разпознават   различни

консенсусни промотори. Действието им е сходно с това на σ

70

. Освен това те също се повлияват от репресорни и

активаторни молекули, които се свързват с ДНК в близост до мястото на свързване на самата полимераза. 

σ

54

 

обаче  значително  се различава  от σ

70

–подобните  фактори  при  

E.coli

. Транскрипцията  на  гените от

комплекса РНК полимераза-σ

54 

се повлиява единствено от активатори, чиито ДНК свързващи места се означават

като енхансери и се локализират на около 80–160 базови двойки upstream от стартовото място. Добре проучен σ

54

активатор е белтъкът NtrC (nitrogen regulatory protein C). Той стимулира транскрипцията на glnA гена. Този ген
кодира   ензима   глутамат   синтетаза,   който   синтезира   АК-та   глутамин   от   глутамат   и   амоняк.   Комплекса   РНК
полимераза-σ

54  

се   свързва   с  промотора   на   glnA,   но   не  предизвиква   топене   на   ДНК  веригата   и  инициация  на

транскрипцията преди да е активиран от NtrC белтъка. NtrC се регулира от протеинкиназа NtrB. В отговор на ниски
нива на глутамин NtrB фосфорилира NtrC, който се свързва с енхансер  upstream  спрямо промотора на glnA. В
резултат   на   това   σ

54

  полимеразата   къса   двете   вериги   на   ДНК   и   инициира   транскрипция.   NtrC   притежава   и

АТФазна активност. Хидролизата на АТФ е необходима за активирането на σ

54

 полимеразата. Доказателство за

това   е,   че   σ

54

  полимеразата   при   мутанти,   при   които   е   засегната   АТФазната   активност   на   NtrC,   не   може   да

предизвика раделяне на двете вериги на ДНК молекулата. Контролът на гена glnA зависи от два белтъка NtrC и
NtrB. Такива 

двукомпонентни регулаторни системи

 контролират много от бактериалните клетъчните отговори

при промени в околната среда.

background image

Белтъците   PhoR   and   PhoB   на  

E.coli

регулират   транскрипцията   в   зависимост   от
концентрацията   на   свободен   фосфор.  PhoR  е
трансмембранен   белтък,   локализиран   в
плазмената мембрана. Периплазменият му домен
свързва   фосфата   с   ограничен   афинитет.
Цитозолният му домен проявява протеинкиназна
активност.  PhoB  е   цитозолен   белтък.   Големите
пори по повърхността на външната мембрана на

E.coli

  осигуряват   дифузия   на   йони   между

периплазматичното   пространство   и   външната
среда.   Когато   фосфатната   концентрация   в
средата   е   ниска,   тя   се   понижава   и   в
периплазматичното   пространство.   В   резултат   на
това   фосфатът   дисоциира   от   периплазматичния
домен   на   PhoR.   Това   води   до   конформационна
промяна в цитозолния домен на PhoR и неговата
протеинкиназна   активност   се   проявява.
Активираният PhoR фосфорилира (хидролиза на
АТФ)  аспартатен   остатък   от   страничната   верига
на PhoB, с което го активира. Фосфорилираният
PhoB   индуцира   транскрипция   на   няколко   гена,
които помагат на клетката да оцелее в условия на
фосфатна липса. 

background image

7.   Контрол   на   транскрипцията   при   еукариоти.   Контролни   елементи,   полимерази   –   структура   и

функции. Регулаторни елементи при еукариотни белтък-кодиращи гени. Активатори и репресори. Белтъчни
мотиви. РНК – полимераз

 

 a

     II    иницииращ комплекс. Молекулни механизми на транскрипционния контрол при

еукариоти   –   хроматинова   реорганизация,   хормонален   контрол.   Други   транскрипционни   системи   –
бактериофаги, митохондрии, хлоропласти, архебактерии. 

Транскрипционният апарат в ядрата на еукариотните клетки е доста по-усложнен в сравнение с този при

бактерии. При еукариотните клетки се различават три типа РНК полимерази, означени като I, II и III. Тези ензими
представляват различни белтъчни комплекси, но притежават и някои еднакви субединици. Всяка РНК полимераза
изпълнява специфична функция и разпознава точно определена промоторна секвенция.

РНК полимераза I

 отговаря за синтезата само на един вид РНК, известен като прерибозомална РНК или

пре-РНК. Тя носи прекурсори за синтезата на 18S, 5.8S и 28S рРНК. Промоторите на РНК полимераза I варират
изключително много между отделните видове организми. 

РНК полимераза III

  осигурява получаването на  тРНКите, на  5S рРНК  и на  някои малки специализирани

РНКи. Промоторите, които  се  разпознават от този ензим,  са  добре  проучени.   Някои от последователностите,
регулиращи инициацията на транскрипцията, се разполагат в рамките на самия ген, докато други са локализирани
upstream спрямо стартовия сайт. 

Основната   функция   на

РНК полимераза II

  е да синтезира  иРНК  и  някои специализирани РНК-и. Тя заема централно място в генната

експресия при еукариоти. Състои се от 12 субединици. Най-голямата субединица (RPB1) показва висока степен
на   холожност   с   β'-субединицата   на   бактериалната   РНК   полимераза.   Друга   субединица   (RPB2)   е   близка   по
структура   с  бактериалната   β-субединица.   Още   две   други   субединици   (RPB3   and   RPB11)  показват  сходство   с
двете бактерилани α–субединици. Най-голямата субединица на РНК полимераза II притежава дълга  C–крайна
опашка, изградена от консенсусни повтори на седем последователни аминокиелинни остатъка –YSPTSPS–. Този
С–краен домен (

 

 CTD

 

 ) е отделен от основата част на ензима посредством неструктурирана линкерна секвенция.

РНК полимераза II единствена притежава CTD-домен

Съществуват хиляди промотори с разнообразни нуклеотидни последователности. Много от промоторите

на РНК полимераза II притежават TATA box (еукариотна консенсусна последователност TATAAA) в близост до -30
и Inr секвенция (инициатор) в близост до стартово място.

Процесът на транскрипция от РНК полимераза II може да се опише в няколко отделни фази: асемблиране,

инициация, елонгация и терминация. Всяка от тях изисква специфични белтъчни фактори. 

При   еукариотите,   подобно   на   бактериите,   ДНК

секвенциите,   които   определят   къде   да   се   залови   РНК
полимеразата   и   от   къде   да   започне  

инициацията

  на

транскрицията   на   дадения   ген,   се   означават   като  промотори.
Транскрипцията   от   даден   промотор   се   контролира   от   ДНК–
свързващи   белтъци   или  транскрипционни   фактори,   които   са
аналогични   на   репресорите   и   активаторите   при   бактериалните
клетки. ДНК контролните елементи при еукариотите, към които се
асоциират транскрипционните фактори, са доста по-отдалени от
промотора, който регулират, в сравнение с тези при прокариоти. В
някои   случаи   транскрипционните   фактори   се   свързват   на
разстояние   десетки   хиляди   бази   upstream   или   downstream   от
промотора.   В   резултат   на   това   транскрипция   под   контрола   на
един   промотор   може   да   се   регулира   от   множество
транскрипционни   фактори,   асоциирани   към   алтернативни
контролни елементи, с което се осигурява  комплексния контрол
на генната експресия. Основните транскрипционни фактори (TFII)
са силно консервативни при всички еукариотни организми. 

Формирането   на   затворения   комплекс   започва   със

асоциирането на  TATA-свързващия белтък (TBP)  към TATA box.
TBP усуква ДНК под ъгъл 90

о

. TBP не се свързва сам, а с група от

фактори – Т

  AF

    (

  TBP

 

 –

  асоциирани фактори).

При еукариотни промотори без ТАТА-box първоначално се

свързват ТAF  и те карат TBP да инициира огъване в ДНК. Към
транскрипционния   комплек   се   присъединяват   още   факторите
TFIIB  (свързва   се   по   посока   на   транскрипцията)   и  TFIIA
(стабилизира   TFIIB-TBP   комплекса   върху   ДНК).   Следва
асоциирането   на  TFIIF  и   на   РНК   полимераза   II   към   TFIIB-TBP
комплекса.   Факторът   TFIIF   контактува   със  CTD–домена   на
полимеразата.   Наподобява   σ-субединицата   при   бактерии,   тъй

background image

като подпомага насочването на полимеразата към промоторите й. Дотук
формираният   комплекс   се   означава   като  преиницииращ   комплекс.   С
прибаването   и   на   последните   два   фактора  TFIIE  и  TFIIH  се   образува
затворен комплекс. TFIIH притежава хеликазна активност, която осигурява
разплитането   на   ДНК   в   близост   до   стартовото   място.   Процесът   е
енергийно   зависим.   TFIIH   притежава   и  киназна   активност,   която   се
проявява   върху   серинов   остатък   на   пето   място   в  тандемния  повтор   на
CTD-домена  (Tyr-Ser-Pro-Tre-Ser-Pro-Ser).  Фосфорилирането   на  

 

 CTD

 

 -

домена   отключва   транскрипцията.   Генерира   се  отворен   комплекс.
Киназната  активност на  този  фактор  се  контролира  от циклини.  TFIIH е
активен, само когато TFIIE присъства. TFIIE позволява на РНК полимераза
II  да   се   движи   по   ДНК   веригата   при   иницииране   на   транскрипцията.
Започва   синтезата   на   РНКовия   транскрипт.   Инициацията   на
транскрипцията приключва с фосфорилирането на CTD домена. 

Когато 5`  краят на транскрипта се покаже от РНК полимеразата,

той   се   разпознава   от  кепиращият   комплекс.   Прибавя   се   шапка.  Само
транскриптите на РНК полимераза II се кепират. При останалите две РНК
полимерази   (I  и  III)  липсва  CTD-домен   и   затова  рРНК   и   тРНК   нямат
„шапки”.

След   синтезата   на   първите   60   до   70   нуклеотида   TFIIE   и   TFIIH

напускат комплекса и полимеразата навлиза във фазата на  

елонгация

.

Елонгацията се повлиява положително от наличието на белтъци, известни
като фактори на елонгацията.  TFIIF  остава свързан с РНК полимеразата
по време на елонгацията. Елонгационните фактори потискат прекъсването
на транскрипционния процес и освен това координират взаимодействията
между   белтъците,   осъществяващи   постранскрипционния   процесинг   на
иРНК.

При получаване на завършен РНК-ов транскрипт, транскрипцията

се терминира.  Полимеразата се дефосфорилира  и е готова за синтезата
на нов транскрипт. 

Ако   по   дължината   на   ДНК   матрицата   се   установят   увреждания,

РНК   полимеразата   преустановява   действието   си.   Процесът   е   известен
като  

репарация

  по време на транскрипцията. При прокариотите в такъв

момент   РНК   полимеразата   се   откача,   докато   при   еукариотите   участват
белтъчни фактори, с помощта на които полимеразата остава в близост до
участъка. Не се откача от ДНК, т.е. транскрипцията не се преустановява
напълно. Друг фактор, който може да доведе до спиране дейността на РНК
полимеразата, е локално струпване на Г-Ц двойки или необходимост от
разрехавяване на хроматина.

Терминацията

 на транскрипцията протича в рамките на 2000-3000

нуклеотида след като РНК полимераза II премине сайта за полиаденилиране (poly(A)-site). Факторите, отговорни
за терминацията, не са известни все още. 

Регулация

: Експресията на белтък-кодиращите гени се регулира от множество ДНК секвенции, към които

имат   афинитет   определени   белтъчни   молекули.   Такива   нуклеотидни   последователности   се   означават   като
транскрипционни контролни региони. Към тях се отнасят промоторите, както и други типове контролни елементи,
които се намират в близост до стартовото място за транскрицията или пък са доста отдалечени от него.

1)

 

промотори:

Клетъчни   или   вирусни   белтък-кодиращи   гени,   които   показват   висока   честота   на   транскрипция   в

определени   моменти   от   жизнения   цикъл   или   в   специфични   диференцирани   клетки,   се   характеризират   с
наличието на консервативната секвенция ТАТА

 

    box. Разположена е на разстояние 25-30 базови двойки upstream

от стартово място. Промени в ТАТА box оказват съществен ефект върху честотата на транскрипция на дадения
ген.  Функцията   на  ТАТА  box  е подобна  на  тази  на  промотора  при  прокариоти,   тъй  като  тя  позиционира  РНК
полимераза II така, че да да инициира транскрипция.

Някои еукариотни гени вместо ТАТА box притежават алтернативна промоторна секвенция, нарчена

инициатор

 

   (

   Inr  секвенция

 

 ). Обикновено  при повечето  активатори на  -1 позиция  има  цитозин,  а на +1  аденин.

Областта от нуклеотиди около инициатора определя силата на промоторите.

Транскрипцията на гени с ТАТА  box или инициаторен елемент в промотора започва от точно определно

място.

В клетката са налице множество белтък-кодиращи гени, при които транскрипцията започва от различен

сайт в рамките на 20 до 200 нуклеотидни двойки. Получават се иРНК молекули с различни краища. Следователно
и N-краят на кодираните от тях белтъци ще бъде различен. Това има отношение при сортирането на белтъците в
ЕПР, тъй като N-краят представлява своеобразен сигнал за насочване. 

Гените,   чиято   честота   на   експресия   в   клетката   обикновено   е   ниска,   не   съдържат  ТАТА  box  или

инициаторно   място.   Такива   са  housekeeping  гените,   които   кодират   ензими   от   междинния   метаболизъм.   При
повечето   от   тях   са   установени  ЦГ-богати   последователности   (

 

 CpG

 

 -острови),  разположени   на   около   100

нуклеотидни двойки upstream спрямо стартовото място за транскрипция.

background image

Проксималните   промоторни   контролни   елементи  се   разполагат   на   разстояние   100-200   нуклеотида

upstream спрямо стартовото място. В някои случаи те са клетъчно специфични, тъй като функционират само при
определени диференцирани клетки.

2)

 

енхансери:

Характерно   за   транскрипцията   на   еукариотните   гени   е,   че   за   някои   от   тях   съществуват   активиращи

контролни елементи, разположени на разстояние от порядъка на хиляди бази спрямо страртовото място. Такива
секвенции се означават като енхансери. Подобно на проксималните промоторни елементи, енхансерите също
проявяват клетъчна специфичност. Енхансерните последователности могат да активират транскрипцията на един
или   повече   гени.   Разположени   са   на   много   големи   разстояния   спрямо   промоторната   област.   Разполагат   се
upstream,  downstream  (в   близост   до   терминаторните   области)   или   в   интроните   на   самите   транскрипционни
единици.

Енхансерите се срещат много рядко в бактериалния геном.
При дрожи е установено, че геномът им съдържа  

upstream  активиращи последователности

, които са

близки до енхансерите и проксималните промоторни елементи.

Един от добре проучените енхансери е този за интерферон β. Състои се от четири контролни елемента ,

които свързват четири различни транскрипционни фактора. Присъствието на HMGI белтъка (свързан с хроматина)
осигурява   високата   кооперативност   при   свързването   на   транскрипционните   фактори.   Получава   се   структура,
наречена енхансозома. HMGI се свързва с малката бразда и силно огъва ДНК в този участък. Към него се свързва
транскрипционният фактор АТF-2/c-Jun  (чрез левцинов цип). Притежава хистонацетилтрансферазна активност.
Ацетилирането на  хистоните води до  разрехавяване  на  хроматина.  Атакува   Н2  и  Н4.  p65/р50  и  IRF  също  са
транскрипционни фактори и се свързват в енхансозомата. HMGI не е транскрипционен фактор. Взаимодействието
му с ДНК и с останалите компоненти стабилизира енхансозомата. Формирането на такъв  loop  в ДНК улеснава
действието на топоизомеразата. Освен това осигурява в съседство РНК полимераза, като повишава локалната й
концентрация   спрямо   промотора.   РНК   полимеразата   има   по-лесен   достъп   до   бримката.   Ако   енхансерна
последователност се премести в близост до промотор без енхансер, транскрипцията на атакувания промотор се
увеличава   значително.   Енхансерните   последователности   се   контролират   чрез   химични   модификации   на
факторите, които се свързват към тях (фосфорилиране и дефосфорилиране). 

3)

 

транскрипционни фактори (белтъци репресори/активатори):

Подобно на прокариотите, и при еукариотите съществуват белтъци активатори и белтъци репресори на

генната активност. Най-общо активторните протеини притежават едни или повече активаторни домени, които се
свързват посредством флексибилен белтъчен домен към ДНК-свързващ домен. Репресорите са функционални
антагонисти на активаторите. Те могат да инхибират транскрипцията на ген, който нормално не регулират, тъй
като свързващото им място е разположено на няколко стотин базови двойки от стартовия сайт на гена. Повечето
репресорни   белтъци   се   състоят   от   два   функционални   домена:   ДНК-свързващ   домен   и   репресорен   домен.
Репресорните и активаторни домени запазват активността си дори при фузия с друг ДНК-свързващ домен.

ДНК-свързващите   домени

  на   активаторните   и   репресорни   белтъци   при   еукариотните   клетки   се

отличават   със  огромно   разнообразие   от   структурни   мотиви,   които   разпознават   специфични   ДНК
последователности. Обикновено взаимодейството им с ДНК е на базата на формиране на нековалентни връзки
между атомите от α-спирала и върховете на базите в голямата бразда. Установени са и взаимодействия и  с
атомите от захарофосфатния скелет, както и с тези от малаката бразда на ДНК, но по-рядко. Такива мотиви са
установени за първи път при репресорните белтъци на прокариоти.

Белтъчният мотив, който е най-широко застъпен сред 

прокариотните

 репресори, е helix

 

 -  turn

 

 -  helix.

Много   от  

еукариотните

  транскрипционни   фактори,   които   участват   в   процесите   на   развитие,   се

отличават   с   консервативна   аминокислеинна   последователност   от   60   остатъка.   Този   белтъчен   мотив   силно
наподобява  helix-turn-helix  мотива при бактерии. Такива транскрипционни фактори са известни като  homeobox
белтъци. Открити са за първи път при дрозофила. Взаимодействат с голямата бразда в АТ-богата секвенция,
която се разпознава от α-спиралата. 

“Zinc

 

 -  fingers” белтъците се отличават с райони, които се нагъват около един централен цинков йон и

придобиват компактна структура. Zn

2+ 

се свързва координационно. Една такава последователност може да бъде

повторена няколко пъти в рамките на един транскрипционен фактор. Съществуват няколко класа “zinc-finger  “
мотиви:

С

2

Н

2  

zinc-finger e най-разпространения ДНК-свързващ мотив, кодиран от генома на бозайници.

Среща се и при растения, но не е с доминантно значение. Състои се от 23-26 аминокиселинни остатъка, от които
два цистеинови и два хистидинови са консервативни. Транскрипционните фактори, които притежават този мотив,
се свързват в голямата бразда на НК. Мотивът е 3-4 пъти повторен в рамките на белтъчната молекула. Тези
фактори се свързват като мономери.

С

4  

zinc-fingers са открити в транскрипционни фактори, които представляват ядрени рецептори.

Първоначално са открити при рецепторите за стероидните хормони. Обикновено такива белтъци съдържат два
цинкови пръста от този тип. Свързват се към ДНК като хомо- или хетеродимери.

С

6

  (Gal4)   притежава   глобуларна   структура.   Свързва   два   цинкови   йона.   По   начина   си   на

взаимодействие приличат на левциновите ципове.

“Winged helix” мотива присъства при хистон Н5, който се свързва като мономер.

Левциновите ципове  са  структурни  мотиви за голям  клас  от транскрипционни фактори.  На  всяка

седма позиция в ДНК-свързващия домен е налице хидрофобната АК левцин. Такива белтъци се свързват като
димери. Към групата на левциновите транскрипционни фактори се отнасят и b

  -тип циповете, които обаче не са

толкова добре структурирани като левциновите. Най-общо се формира хидрофобна област във всеки мономер,
след което те се затварят като цип.

Това е само предварителен преглед!

Лекции по Молекулярна биология

Транскрипция – етапи и молекулни механизми. Инициация на транскрипцията. Контрол на транскрипцията при еукариоти. Завършване на транскрипцията при прокариоти – Rho–зависим и Rho–независим механизъм, атенюация и антитерминиращ механизъм...

Лекции по Молекулярна биология

Предмет: Молекулярна биология, Биология
Тип: Лекции
Брой страници: 22
Брой думи: 11885
Брой символи: 75494
Изтегли
Този сайт използва бисквитки, за да функционира коректно
Ние и нашите доставчици на услуги използваме бисквитки (cookies)
Прочети още Съгласен съм